具有与细胞外基质相似的特性并具有合适的生物打印特性的生物材料对于血管组织工程至关重要。为了寻找合适的生物材料，本研究研究了三种水凝胶：海藻酸盐/透明质酸/明胶（Alg/HA/Gel）、预交联海藻酸二醛与明胶（ADA-GEL）和甲基丙烯酰明胶（GelMA）它们的机械特性以及人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 的存活、迁移和增殖。此外，将 HUVEC 的行为与其在基质胶中的行为进行了比较。为此，将 HUVEC 作为单细胞和细胞球体与墨水混合，并使用基于挤出的生物打印进行打印。所有油墨均具有良好的印刷适性和形状保真度。流变测量证明了油墨的胶凝一致性和剪切稀化行为。测定了水凝胶的不同杨氏模量。然而，所有测量值都在文献中定义的范围内，导致迁移和发芽，以及协调迁移与粘附。ADA-GEL 和 GelMA 水凝胶中的细胞存活和增殖已持续 14 天。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，单细胞在 7 天内发生细胞死亡。在 ADA-GEL 和 GelMA 中观察到 HUVEC 球体的萌芽和迁移。在基质胶中观察到球体的类似行为。相比之下，Alg/HA/Gel 墨水中的球体随着研究时间的推移而死亡。研究表明，Alg/HA/Gel并不能为HUVEC的长期生存提供良好的环境。
由于心血管疾病仍然是死亡和发病的主要原因之一，特别是在人口不断老龄化的背景下，对血管置换的需求以及理想情况下工程血管和血管假体的出现正在增加。目前，血管移植的选择仍然非常有限。一方面，同种异体替代物的通畅率较低，而同种异体和异种血管移植物会产生免疫排斥，因此可能导致严重的问题，包括术后狭窄引起的收缩，因此对先进工程移植物的需求巨大[ 1]。然而，即使是合成移植物也仍然存在缺点。因此，为了克服这些限制，研究人员不断寻找新的生物材料和新的材料成分[ 2 ]。合适的生物材料的主要目标是模仿自然组织以实现功能和结构组织的形成[ 3 ]。因此，细胞生长和血管生成的理想条件是细胞外基质（ECM），正如人体内所发现的那样[ 4 ]。为此，进行了复杂的体内实验来分析植入结构的血管生成[ 5]。ECM 由各种类型的蛋白质和聚糖组成。它为细胞生长提供结构和生化支持，为细胞提供生化和生物力学刺激，从而触发组织分化和细胞器发育[ 3 , 6 ]。尽管 ECM 的构建模块都具有非常高的生物相容性，但它们无法像合成聚合物那样精确制造 [ 4]。在 3D 生物打印应用中，基于水凝胶的墨水被用作构建支架的基质，最初可以由合成或天然聚合物组成。合成聚合物易于处理，并且可以根据特定应用调整其性能。然而，它们通常生物相容性较差；因此，天然水凝胶受到青睐。因此，用于 3D 生物打印应用的墨水必须具有可打印性和生物相容性，并且还应具有合适的机械和结构特性 [ 1 ]。水凝胶是亲水性聚合物网络，可以吸收大量的水，并且由于其柔软的橡胶稠度，为封装的细胞提供了一个类似组织的环境[ 7]。基于海藻酸二醛（ADA）的水凝胶由于其生物相容性、生物降解性和快速降解速率而非常适合作为组织工程材料[ 8 ]。由于海藻酸盐具有生物相容性并能快速离子胶凝，因此适合细胞封装和生物制造。海藻酸盐的使用受到材料与细胞相互作用不足和细胞粘附效率低的限制。然而，通过与藻酸二醛（ADA）共价交联掺入明胶可以克服这些限制。ADA-GEL 中的明胶是一种可生物降解的蛋白质，由胶原蛋白的酸性或碱性水解产生 [ 9]。明胶特别适合血管组织工程，因为它具有促进血管生成的某些特性[ 10 ]。例如，明胶含有整合素结合基序 (RGD) 序列，使内皮细胞能够降解水凝胶、迁移、扩散并提供足够的细胞附着 [ 10 , 11 ]。由于明胶是由胶原蛋白产生的，因此它具有类似的细胞功能，并且对于细胞增殖和分化也很重要[ 12 , 13 ]。ADA-GEL 在组织工程和生物制造方面的潜力已得到证明 [ 14 , 15 ]。
2021 年，施密德等人。(2021)[ 7 ]报道了另一种海藻酸盐-明胶基墨水，其由海藻酸盐、透明质酸(HA)和明胶(Alg/HA/Gel)三种成分组成。海藻酸盐是一种源自褐藻的多糖，而透明质酸是一种天然糖胺聚糖，几乎存在于所有结缔组织中。由于HA是一种天然的细胞外基质材料，具有天然的生物相容性和水结合特性，因此适合作为组织工程的生物聚合物。HA在体内许多细胞活动和组织功能中发挥着重要作用，例如细胞迁移、增殖、分化和血管生成[ 16 ]。新开发的 Alg/HA/Gel 墨水已被证明具有良好的印刷适性、高形状保真度和高肿瘤细胞存活率。7 ]。
此外，还有经过改性的明胶基油墨。例如，明胶的生物降解可以通过丙烯酸甲酯 (MA) 的官能化来适应，从而产生甲基丙烯酰明胶 (GelMA)。由于粗明胶形成水凝胶，机械强度低且在细胞培养物中呈液体，因此使用交联化学物质来提高硬度 [ 17 , 18]。共价交联水凝胶的形成是通过光引发剂系统在温和条件下实现的，该系统触发自由基的形成，使明胶内部的各种甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯基团聚合。在光引发剂存在的情况下，墨水的曝光通过在蛋白质链之间形成不可逆的化学交联来增加水凝胶的稳定性，并导致细胞的封装，这使得它们具有高度的活性[ 10 , 11 , 19 ] ]。将 HUVEC 封装在 GelMA 中以及将 GelMA 用于软组织工程应用已在文献中得到成功证明 [ 10 , 11 ]]。相比之下，用于生物打印的水凝胶 Alg/HA/Gel 和 ADA-GEL 中以单细胞和球体形式封装 HUVEC 的描述很少，甚至根本没有文献 [ 20 ]。因此，在下面的研究中，使用基于挤出的生物打印机打印了包含 HUVEC 的三种墨水的小支架。与传统水凝胶模型相比，基于挤出的生物打印具有以下优势：水凝胶和细胞可以以不同浓度结合，形成大孔结构和复杂的 3D 架构 [ 7 , 21 ]，并可用于血管模型 [ 22 ]。此外，基于挤出的生物打印具有简单性、经济性、准确性和可重复性的特点。23 ]。
在这里，内皮细胞在不同的水凝胶中以单细胞和细胞球体的形式打印，以创建 3D 微环境。分析了油墨的机械性能，例如硬度和降解行为。对于成功的印刷工艺，进一步研究了油墨的流变特性和印刷适性。为了研究内皮细胞在不同墨水中的行为，对单个细胞的代谢活动、细胞存活和排列进行了 14 天的观察。对球体的发芽、迁移、存活和排列进行了 7 天的研究。为了最佳地比较打印结构中细胞的行为，单细胞和球体都另外打印在基质胶中。
添加各种补充剂后，在 Lonza Clonetics（瑞士巴塞尔）的 500 mL 内皮细胞生长培养基 2 (EGM-2) 中培养 HUVEC hTERT2（Evercyte GmbH，维也纳，奥地利）细胞系。共 50 mL FCS 上级（标准化胎牛血清，Biochrom GmbH，柏林，德国），2.0 mL 重组人成纤维细胞生长因子-B（rhFGF-B），0.5 mL 重组胰岛素样生长因子（R 3 -IGF- 1)、0.5 mL 重组人表皮生长因子 (rhEGF)、0.5 mL 血管内皮生长因子 (VEGF)、0.5 mL 肝素、0.5 mL 抗坏血酸、0.5 mL 遗传霉素（终浓度 20 µg/mL，Thermo Fisher Scientific，Waltham，添加 0.2 mL 氢化可的松。培养箱设置为 5% CO 2和37°C。每周更换培养基 3 次，以保证营养供应恒定。
ADA-GEL 是按照 Hazur 等人的方案制备的。（2020）[ 24 ]。第一步，制备 2 mL 6.25 wt.% ADA 储备液（13% 氧化度）（由藻酸盐 VIVAPHARM ® PH 163 S2 JRS PHARMA GmbH & Co. KG，Rosenberg，德国制备）。为此，将 0.125 g ADA 和 2 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）均匀溶解在 50 mL 烧杯中，并持续搅拌。同时，第二种溶液由 6.25 wt.% 明胶（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）组成，溶于含有 250 mmol/L CaCO 3的 PBS （用于分析的碳酸钙沉淀，EMSURE ®，Merck KGaA，达姆施塔特，德国）准备好了。为此，将 0.188 g 明胶溶解在热板上的 3 mL PBS 中，并持续搅拌。一旦明胶完全溶解，加入75 mg CaCO 3，并将溶液再均质化10分钟。一旦含有 ADA-GEL 的储备液完全溶解，加入 2 mL 第二次制备的明胶/CaCO 3使用微量移液器添加溶液并在 37°C 下再搅拌 20-30 分钟。同时，准备了第三个也是最终的解决方案。为了制备 2 mL 250 mmol/L D-葡萄糖酸-δ-内酯（GDL，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）溶液，将含有 89 mg GDL 的 2 mL 超纯水搅拌 1 分钟。该溶液应在混合步骤之前制备。将1mL的GDL溶液滴加到ADA-GEL/CaCO 3混合物中，并将整个混合物在37℃下搅拌3小时。搅拌墨水后，可以将其与细胞一起小心地转移到墨盒中进行 3D 打印。
墨水是根据 Schmid 等人的方案制备的。（2021）[ 7 ]。该墨水由 3 wt.% 明胶（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）、0.5 wt.% 海藻酸盐（Alginate PH 176，JRS Pharma GmbH &Co. KG）和 0.1 wt.% HA（高分子）组成。重量透明质酸 1-2 MDA，CarboSynth Ltd.，康普顿，英国），全部溶解在 PBS 中。称取 0.3 g 明胶、0.05 g 海藻酸盐和 0.01 g HA，并溶解在含有 10 mL PBS 的烧杯中，在 37°C 下磁力搅拌器溶解 1.5 h。烧杯上覆盖有密封膜（PARAFILM ® M，100 mm，75 m，Roth，Karlsruhe，德国）。
用于墨水的 GelMA 根据 Loessner 等人中描述的方案合成。(2016) [ 19]。为此，将 6 g 明胶 A（猪，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）溶解在 50 mL PBS 中，并与 12 mL 甲基丙烯酸酐（MA，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）混合，美国）在 50°C 下搅拌 1 小时。通过添加温热的 PBS 终止甲基丙烯酸化过程。然后将溶液在 37°C 下透析一周并冻干另一周。获得的 GelMA 的估计功能化程度约为 80%。将其储存于-20°C。为了制备墨水，将 4 wt.% 产生的 GelMA 溶解在 PBS 中。为此，称重 80 mg GelMA，并在合适的烧杯中于 1.8 mL PBS 中于 37 °C 匀浆，持续搅拌 30 分钟。在避光条件下，称取 10 mg 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂 (LAP, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，溶解在 PBS 中，并添加到均质化的 GelMA 溶液中，使溶液中 LAP 的浓度为 0.1 wt.%。为了使添加的 LAP 溶液完全均化，在避光条件下再搅拌 10-15 分钟。
首先除去培养基，然后用 PBS 洗涤细胞，将用于打印的单细胞从 T-75 细胞培养瓶（TC-flask T75，Sarstedt AG & Co. KG，Nümbrecht，德国）中分离。通过添加 Accutase（Merck KGaA，圣路易斯，密苏里州，美国）启动分离过程，孵育 4 分钟。温育后，将accutase细胞悬浮液用PBS稀释，转移至Falcon管中并离心。离心后，吸出上清液，使细胞在 Falcon 管底部成束成团（Falcon Conical Centrifuge Tubes，Corning，New York，NY，USA）。每 1 mL 墨水总共使用 5 × 10 6 个HUVEC 细胞。
使用悬滴法生成球体。为此，首先通过在 500 mL 瓶中对 6 g 甲基纤维素（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）进行高压灭菌来生成甲基纤维素培养基。然后，将 250 mL 基础培养基加热至 60 °C 并添加到甲基纤维素中。将溶液在室温下在磁力板上搅拌20分钟。20分钟后，将另外250mL介质添加至溶液中，并将整个溶液在4℃下搅拌过夜。第二天将体积为 500 mL 的溶液转移至 10 个 50 mL Falcons 中，并在 4 °C 下以 3500× g离心 300 分钟。猎鹰体内生成的甲基纤维素培养基储存在 4°C 下。为了产生悬滴，按照第 2.3.1 节所述分离细胞，并对 Falcon 中的细胞进行了计数。将750×10 3 个细胞悬浮于20mL HUVEC细胞培养基和5mL甲基纤维素培养基中，获得总共1000个球体，每个球体750个细胞。使用多吸管在矩形培养皿上产生体积为 25 μL 的液滴。将培养皿倒置并在 37°C、5% CO 2的培养箱中保存过夜。第二天，可以收获球体。为此，用 PBS 将球体从培养皿中冲洗下来并转移到 Falcon 上。然后将 Falcon 在 300× g、22 °C 下离心 4 分钟。减速度设置为零。再次吸出上清液。
使用 Cellink Inkredible+（Cellink，波士顿，马萨诸塞州，美国）打印机进行打印。使用移液管，将细胞 (10 × 10 6 ) 和球体 (1000 à 750 个细胞) 小心地用 2 mL 墨水重悬，然后转移到 3 mL 墨盒中进行打印（图 1 a）。随后，将凝胶填充墨盒（GelMA 和 Alg/HA/Gel；ADA-GEL 需要中间步骤）在 15 °C 水浴中冷却 6 分钟，以获得足够的粘度和真实的打印结果。在冷却过程之前，将盒装满 ADA-GEL 和细胞并放入离心机中。872× g时7分钟，去除凝胶中的气泡。随后，将墨盒放入 15°C 水浴中 6 分钟。使用内径0.41毫米、长度127毫米的锥形针打印1厘米2脚手架（三层网格）。为了打印 GelMA 墨水，使用了相同直径的锥形防紫外线针和防紫外线墨盒。所有墨水均使用 20-25 kPa 的压力。压力范围是由打印机内的轻微波动温度决定的。与墨盒中的墨水不同，针中的墨水没有冷却。因此，印刷完成后，必须在短时间内稍微降低压力，以进行下一次印刷过程。每个支架由三层六股组成。可以在培养皿中连续打印四个支架（图 1 b）。打印四个支架大约需要 15 分钟。生物学实验可以一式三份进行（n = 3）。
图 1. ( a ) 打印过程中的墨盒，用黑色针阻挡紫外线。( b ) 使用 ADA-GEL 成功打印后，培养皿中的四个支架。随后发生交联。( c ) 一份用基质胶打印的样本。形状保真度不足是显而易见的。由于已知 Matrigel 不具有足够的机械性能，因此也没有进一步分析。比例尺 = 1 厘米。
细胞和球体也打印在标准材料基质胶（Corning®Matrigel®基底膜基质，康宁生命科学公司，图克斯伯里，马萨诸塞州，美国）中。为此，将基质胶在 4°C 下解冻过夜。将液体基质胶小心地与细胞悬浮并填充到盒中。为了获得增加的粘度，将柱在室温下凝胶化约10分钟。之后，可以使用 3-5 kPa 的低得多的压力打印基质胶（图 1 c）。为了使基质胶完全胶凝，随后将支架置于37℃和5%CO 2 的培养箱中30分钟，然后添加培养基。
基于藻酸盐的油墨通常与二价阳离子交联，例如Ca 2+。凝胶网络的形成是因为一条藻酸盐链二聚化并与许多其他藻酸盐链形成键[ 25 ]。由于预交联的ADA-Gel在培养基中表现出相对快速的分解，因此已发现将微生物转谷氨酰胺酶(mTG，A**omoto，东京，日本)添加到CaCl 2溶液中用于交联是有用的。通过添加 mTG，可以实现更慢的降解速度 [ 24 , 26 ]。为了制备溶液，100 mM CaCl 2（二水氯化钙，Merck KGaA，达姆施塔特，德国）在烧杯中与 5 wt.% mTG 混合，然后在室温下添加到构建体中 10 分钟。打印后在室温下将Alg/HA/Gel与100 mM CaCl 2交联10分钟。含有光引发剂 LAP 的 GelMA 生物墨水与手持灯 (405 nm) 在 5-10 cm 的距离处交联 30 秒。
所有打印的支架（ADA-GEL、Alg/HA/Gel 和 GelMA）随后用培养基洗涤并转移到含有细胞培养基的 6 孔板中。含有单细胞的构建体在37℃和5%CO 2下孵育14天，含有球状体的构建体孵育7天。每周更换培养基 3 次。为了刺激发芽，还将佛波醇 12-mristate 13-acetate（PMA，浓度 100 ng/mL，Abcam，剑桥，英国）添加到含有球体的支架的培养基中。PMA强烈刺激HUVEC的血管生成，当添加适当浓度时，会加速HUVEC的迁移和网络形成[ 27 ]。
为了进行活/死测定，用钙黄绿素-乙酰氧基甲基（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）和碘化丙啶（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）进行染色。单细胞染色在第 1、7 和 14 天进行，而球状体在第 0、1、2、3、4 和 7 天进行染色。对于三个支架的染色，将钙黄绿素-AM (2.01 µM) 放入将细胞培养基置于避光的 Falcon 中，并将碘化丙啶 (1.5 µM) 与另一避光的 Falcon 中的培养基匀浆。将支架转移至24孔板。将 500 μL 钙黄绿素-AM/培养基混合物添加到含有一个支架的每个孔中，并将板置于培养箱中，在 37 °C 和 5% CO 2下培养 30 分钟。然后小心吸出钙黄绿素-AM溶液，并将500 μL碘化丙啶混合物添加到支架中。将板在黑暗中在室温下孵育5分钟。随后，吸出碘化丙啶溶液，将 1 mL 汉克平衡盐溶液（HBSS，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）移入孔中洗涤 15 分钟。15 分钟后不暴露在光下，去除 HBSS，并将 500 μL HBSS 添加到支架中。然后，通过荧光显微镜（Olympus IX-83，cellSens Software V1.16，Olympus Corporation，东京，日本）分析支架。根据标准程序在表面和凝胶内 100 µm 处拍摄每个支架三张图像。使用开源软件FIJI（版本：2.9.0/1.53t），合并 ImageJ 的分布以及钙黄绿素-AM 和 PI 荧光以评估细胞。每个染色均进行技术三次重复。在第 1、2、3、4 和 7 天，对每个生物重复 (n = 8) 的球体进行测量。第 0 天的球体染色重复两次，并记录每个水凝胶的两个球体。手动计数活细胞和死细胞。使用 FIJI 程序从细胞核心开始手动测量球体芽的长度。确定了三个最远迁移的细胞，并使用 FIJI 测量了迁移距离。第 0 天的球体染色重复两次，并记录每个水凝胶的两个球体。手动计数活细胞和死细胞。使用 FIJI 程序从细胞核心开始手动测量球体芽的长度。确定了三个最远迁移的细胞，并使用 FIJI 测量了迁移距离。第 0 天的球体染色重复两次，并记录每个水凝胶的两个球体。手动计数活细胞和死细胞。使用 FIJI 程序从细胞核心开始手动测量球体芽的长度。确定了三个最远迁移的细胞，并使用 FIJI 测量了迁移距离。
细胞增殖通过水溶性四唑盐 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H- 的减少来指示)四唑（单钠盐）将 NADH 转化为溶解在组织培养物中的黄色甲臜染料。NADH 酶仅在活细胞中具有活性，并且是线粒体中脱氢酶活性所必需的 [ 28 , 29 ]。细胞数量越多，脱氢酶的活性越高，可以产生的染料越多[ 29]。在打印在支架上的单细胞的第 1、7 和 14 天进行增殖测定。为此，将 500 μL HUVEC 细胞培养基和 50 μL WST-8（PromoCell，海德堡，德国）混合在 24 孔板的四个孔中，避光。然后，将打印的三个支架分别转移到一个孔中，留下一个孔作为空白参考。然后将24孔板放入培养箱中培养2小时。2小时后，测量每个样品的吸光度。为此，在不曝光的情况下从四个孔中每一个进一步取出100μL 3次，并转移到每个96孔板的一个孔中。然后将96孔板放入光度计中，通过测量450 nm和600 nm波长处的吸光度作为背景来定量甲臜的量。这里，29 ]。
打印过程结束后，立即测试支架的可打印性。将打印的支架置于光学显微镜下进行光学放大。选择每个支架的支架线的四个不同交叉点。测量交叉点处的线长度（见图2a、b）。这些线应始终相互垂直，就像理想网格中的情况一样。由于针内直径为 410 µm，理想网格交叉处的线的理想长度为 579.828 µm。使用此理想值，可以通过将线的理想长度除以线的平均实际值来确定交点的对角线交叉比 (DCR) [ 30]。使用 20 次技术重复来评估印刷适性测试。
图 2. ( a ) 具有四个选定交叉点的打印支架的表示（改编自 Bednarzig 等人 (2022) [ 30 ]）。( b ) 用 ADA-GEL 打印的支架的示例图片。在交叉点处要小心，以确保标记线始终彼此成直角。使用显微镜测量所示的交叉线长度。比例尺 = 1 毫米。
使用配备 20 mm 板-板几何形状的 DHR-3 流变仪（TA Instruments，New Castle，DE，USA）。珀耳帖元件（底板）用于确保所有测量期间的温度控制。制备完成后，将 200 μL 未固化油墨添加到板-板几何结构之间。将顶板降低至所需的 500 微米测量间隙后，去除多余的材料。流变仪的温度设置为 37 °C。然后，以 2 °C/min 的速度将水凝胶冷却至 15 °C。温度保持 6 分钟，以确保油墨中温度分布均匀。之后，进行振荡实验，测量储能模量G'和损耗模量G''。升温并保持该温度 6 分钟，两次频率扫描，间隔 10 分钟，恒定振荡位移为 1%，递增频率为 0.1–100 rad/s (0.016–16 Hz)，幅度扫描，频率为 10 rad/s，幅度介于测得0.035%和110.5%。根据频率扫描 1 和 2 的测量，还可以确定复数粘度 1 和 2 的值。为了更好的可读性，在以下手稿中，复数粘度的值被称为复数粘度。三个技术复制品由一批墨水组成。还可以确定复数粘度 1 和 2 的值。为了更好的可读性，在以下手稿中，复数粘度的值被称为复数粘度。三个技术复制品由一批墨水组成。还可以确定复数粘度 1 和 2 的值。为了更好的可读性，在以下手稿中，复数粘度的值被称为复数粘度。三个技术复制品由一批墨水组成。
使用来自 CellScale（加拿大安大略省滑铁卢）的 MicroTester LT 测定水凝胶的杨氏模量。为了进行测量，样品是由具有直径为 5 毫米的圆柱形凹槽的硅胶模具铸造而成。每个腔体使用 40 μL 的墨水。然后，油墨根据其交联策略进行交联。将获得的样品储存在每孔含有4 mL HUVEC培养基（+1%青霉素/链霉素）的6孔板中，在37℃和5%CO 2的培养箱中。每周更换介质三次。在第 1、4、7 和 14 天，使用 MicroTester LT 在 HBSS 中于 37 °C 下测量了一批的总共 7 个样品。由于水凝胶的硬度不同，Alg/HA/Gel 墨水使用直径为 0.3048 mm 的微束。对于ADA-GEL和GelMA，根据MicroTester LT的说明使用直径为0.4064mm的微束。样品通过两个压力循环加载。对于第一个循环，选择 2% 的偏转以避免确定 L 0时样品结构的变化价值。对于第二个循环，选择 10% 的偏转来确定杨氏模量。根据计算的应力-应变曲线，确定斜率在2-5%范围内，以获得水凝胶的杨氏模量。MicroTester LT 实验每天对一批样品中的 7 个样品进行。
微小的组织样品、水凝胶微球、细胞球体和工程微组织--高级微量机械测定仪MicroTester--压缩、张力、弯曲、压痕和剪切试验点击了解
用于降解研究的样品是从具有直径为 7 毫米的圆柱形凹槽的硅胶模具中获得的。将 300 μL 的每种墨水添加到孔中，然后交联。随后称量样品以获得初始重量。将样品储存在装有无菌 Falcon 100 μm 细胞过滤器（美国纽约康宁）和 HUVEC 培养基（+1% 青霉素/链霉素）的 6 孔板培养箱中。在第 1 天、第 4 天、第 7 天和第 14 天测定样品的重量。降解研究结果根据两批墨水（每批 5 个样品）确定。这导致在第 0、1、4、7 和 14 天至少进行 10 次技术重复。样品的重量百分比使用公式 (1) 确定。W 0代表样品的起始重量，在第0天测定。W t表示测量当天的重量，与其他研究类似[ 31 ]。
使用 GraphPad Prism 8.1.2（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）进行统计分析。使用以下检验分析组间差异：Shapiro-Wilk 正态性检验，然后进行方差分析和 Tukey 多重比较检验。进行方差分析和 Kruskal-Wallis 多重比较测试来评估杨氏模量之间的差异是否具有统计显着性。显着性p值设置为 ≤0.05。
如图3所示，所有三种水凝胶都具有良好的适印性。对于 GelMA，最低对角交叉比为 0.44 (±0.04)。Alg/HA/Gel 墨水混合物的比率在统计上非显着较高，为 0.46 (±0.04)。ADA-GEL 获得了最佳的印刷适性结果，与其他两种油墨的值相比，其 DCR 具有统计显着性更高的 0.57 (±0.05)。
图 3. 三种水凝胶 Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 打印后的 DCR。数据表示为平均值±标准差。* p < 0.05。
测得的水凝胶温度梯度如图4a所示。所有油墨的储能模量 G' 始终高于损耗模量 G''。在冷却过程中，从储能模量G'的增加可以明显看出油墨的凝胶化。对于 ADA-GEL 和 Alg/HA/Gel，甚至在达到 15 °C 之前就可以观察到储能模量的增加。对于 ADA-GEL，观察到的值约为。Alg/HA/Gel 的温度约为 19 °C。17℃。
图 4. ( a ) 三种测量的水凝胶的温度斜坡。将油墨从初始温度 37 °C 冷却至 15 °C，并保持 6 分钟。左y轴的对数表示。( b ) 样品冷却至 15 °C 后立即进行频率扫描 1。G'表示各凝胶的储能模量，G''表示损耗模量。( c ) 复数粘度 1 的值，与频率扫描 1 一致。( d ) 频率扫描 2：频率扫描 1 后 10 分钟。G' 表示相应凝胶的储能模量，G'' 表示损耗模量。( e ) 复数粘度 2 的值，与频率扫描 2 一致。( 处的轴的双对数图是）。 数据表示为平均值±标准差。
图 4 b、d 显示了凝胶在 1% 恒定变形和频率在 0.1–100 rad/s (0.016–16 Hz) 范围内增加时的行为。G' 始终高于 G''，证实了油墨的凝胶状行为。在 15 °C 时，水凝胶的行为类似于粘弹性固体。在以 10 分钟间隔测量的频率扫描 1 和频率扫描 2 之间，可以观察到小的向上偏移。这可以归因于这样的事实：水凝胶在此期间继续胶凝，并且在频率扫描 1 处尚未达到平衡状态，这从图 4a中已经很明显，因为没有达到平台。进行的幅度扫描证实频率扫描的测量是在线性范围内进行的。
此外，水凝胶的复数粘度如图4c、e所示。随着频率增加，剪切稀化行为非常明显。将复数粘度 1 与与频率扫描 2（10 分钟后）一起记录的复数粘度 2 进行比较，可以看到每个水凝胶在整个频率范围内都有小的向上移动。
比较这些天由 Alg/HA/Gel 制备的样品，没有观察到杨氏模量的显着差异（表 1）。同样，在 1 至 14 天期间测量的 ADA-GEL 样品的杨氏模量没有显示出统计学上的显着差异。对于 GelMA 也可以检测到相同的情况（图 5A）。然而，当对墨水进行相互比较时，可以观察到统计上显着的差异。对于 GelMA，在第一天测量到的杨氏模量在统计上显着高于 Alg/HA/Gel 混合物。同样，Alg/HA/Gel 的杨氏模量在统计上也显着低于 ADA-GEL。此外，在第 4 天，可以测量到 GelMA 和 ADA-GEL 的杨氏模量比 Alg/HA/Gel 具有统计学上显着更高的杨氏模量。第 4 天，GelMA 测量的杨氏模量在统计上也显着高于 ADA-GEL。第7天，GelMA和ADA-GEL的杨氏模量在统计学上显着高于Alg/HA/Gel。在第 14 天，与 Alg/HA/Gel 的杨氏模量相比，只能测量到统计上显着较高的 GelMA 值。看来 GelMA 是最硬的凝胶，而 Alg/HA/Gel 是最软的。在所考虑的所有天数中，ADA-GEL 的杨氏模量均介于 GelMA 和 Alg/HA/Gel 的值之间。
图 5. ( a ) 三种水凝胶的杨氏模量：Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA。( b ) 三种水凝胶的降解行为：Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA。数据表示为平均值±标准差。
表 1. 三种水凝胶 Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 在第 1、4、7 和 14 天的杨氏模量。
24小时后，观察到所有水凝胶的降解（表2，图5b). 对于 Alg/HA/Gel 墨水混合物，在第一天观察到从 100% 到 78.39 ± 11.33% 的统计显着质量损失。在第 7 天观察到 Alg/HA/Gel 进一步损失质量。第 14 天，与第 0 天相比，Alg/HA/Gel 的重量百分比显着降低。第 1 天，ADA-GEL 的质量损失从 100% 降至 91.61 ± 12.36%。此外，对于 ADA-GEL，与第 1 天相比，在第 4 天检测到统计学上显着的体重减轻。在第 7 天，观察到 ADA-GEL 的质量进一步减轻。与第 0 天相比，在第 14 天观察到 ADA-GEL 的百分比显着降低。与第 0 天相比，在第 1 天由 GelMA 墨水生产的样品观察到显着降解至 85.07 ± 7.826%。与第 0 天和第 1 天相比，GelMA 在第 4 天的质量略有增加，在统计学上不显着。在第 7 天，GelMA 的质量损失仅略有增加。第 14 天获得的 GelMA 重量百分比在统计上显着低于第 0 天获得的重量百分比。
表 2. 三种水凝胶 Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 在第 0、1、4、7 和 14 天的降解行为。
与 Alg/HA/Gel 墨水相比，ADA-GEL 在第 1 天记录的值在统计上显着较高。ADA-GEL 和 GelMA 的值在统计上显着高于 Alg/HA/Gel 样品的重量百分比4、7 和 14。对于 Alg/HA/Gel，14 天内检测到总质量损失为 34.87%。对于 ADA-GEL，14 天内观察到总质量损失为 23.82%。对于 GelMA，从第 0 天到第 1 天仅检测到统计上显着的质量损失 14.93%。其他几天的总质量几乎保持不变。
如图6所示，第1天在Alg/HA/Gel中可以识别出大量活细胞。第1天，在总共计数的2442个细胞中，Alg/HA/Gel的存活率为88.27%（在具有 2 个平面的 3 × 3 ROI 中）（图 6）。在 ADA-GEL 中，与 Alg/HA/Gel 相比，第一天就可以检测到相当数量的死亡细胞。相比之下，ADA-GEL 中的存活率为 49.39%，总共计数了 1858 个细胞（在3 × 3 ROI，带 2 个平面）。第一天，GelMA中2007计数的细胞存活率为93.43%。一天后，GelMA 中可检测到最大数量的活细胞。GelMA 和 Alg/HA/Gel 的存活率在统计学上显着高于 ADA-GEL，如图7a所示。可以看出图 7b，第 1 天，所有生物墨水均未显示出表面和 100 μm 深度之间的活细胞差异。此外，在 Matrigel 中，第 1 天可以观察到大量活细胞。
图 6. 第 1、7 和 14 天在支架表面和 100 μm 深度的 Alg/HA/Gel、ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel 中的单细胞。绿色=活细胞，红色=死细胞；10 倍放大倍数。比例尺 = 100 μm。
图 7. ( a ) 每种生物墨水中的总细胞存活率。( b ) 凝胶表面活细胞和 100 μm 深度活细胞的比例。( c ) 生物墨水中单细胞的代谢活性。数据表示为平均值±标准差。* p < 0.05。
就单细胞的代谢活性而言，第一天凝胶之间没有检测到统计学上的显着差异（图7c）。
7天后，大部分打印的细胞在Alg/HA/Gel中死亡，几乎找不到任何活细胞，如图6。总共计数 2823 个细胞，存活率为 3.07%。在 ADA-GEL 中，活/死亡比率与第 1 天大致相同。在总共计数的 2391 个细胞中，ADA-GEL 中的存活率在统计学上显着高于 Alg/HA/Gel 生物墨水，为 45.38% 。第 7 天，在 GelMA 中观察到与 ADA-GEL 类似的存活率。在总共计数的 1785 个细胞中，GelMA 中的存活率为 45.57%。虽然在 Alg/HA/Gel 生物墨水中没有检测到表面和深度之间的差异，但在其他两种水凝胶中可以观察到相当大的差异。据统计，在生物墨水表面观察到明显更多的活细胞。在个别案例中也观察到了细胞与细胞的接触。在 Matrigel 中观察到与 ADA-GEL 和 GelMA 几乎相同的行为。
ADA-GEL 中单细胞的代谢活性在统计上显着高于其他两种凝胶。Alg/HA/Gel 中未检测到代谢活性，这与存活率测定的观察结果一致。在统计上，GelMA 仍显着高于 Alg/HA/Gel。
第 14 天，在 Alg/HA/Gel 中，在总计 3862 个细胞中检测不到更多的活细胞。相比之下，在 ADA-GEL 中，在第 14 天计数的总共 2411 个细胞中，也观察到活细胞比率略有统计学上不显着的增加。在 GelMA 中，在总共计数的 1839 个细胞中，总细胞存活率保持不变，与第 7 天相比没有检测到重大差异（图 7a）。对于 GelMA 和 ADA-GEL 的表面，活细胞数量在统计学上显着高于凝胶内部（图 7 b）。两个支架几乎完全被细胞覆盖，并且可以检测到细胞与细胞接触的增加（图8）。此外，在 Matrigel 中，与第 7 天相比，第 14 天在凝胶表面可以检测到更多数量的细胞-细胞接触。对于 ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel，可以检测到细胞的排列。
图 8. 第 14 天的单细胞图像示例，显示 ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel 中支架表面的细胞与细胞接触。上图：活的（绿色）和死的（红色），下图与相差融合。比例尺 = 100 μm。
可以检测 ADA-GEL 和 GelMA 的代谢活性。由于 Alg/HA/Gel 中没有留下活细胞，因此没有测量代谢活性。因此，第 14 天时，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水中的代谢活性也显着高于 Alg/HA/Gel（图 7c）。与第 7 天相比，第 14 天，GelMA 中检测到代谢活性更高的趋势，因为细胞在表面增殖，并且观察到细胞与细胞接触的数量增加。
第 0 天，所有球体的外观几乎相同（图 9）。外壳是绿色的，这是活细胞的特征，在水凝胶 Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 中，一些死的、染成红色的细胞核稍微透过绿色外壳出现。只有在基质胶中打印的球体的情况下才能识别出红色（死）成分。
图 9. 第 0、1、2、3、4 和 7 天的球体嵌入 Alg/HA/Gel、ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel 中。绿色=活细胞，红色=死细胞；10 倍放大倍数。比例尺 = 100 µm。
从第一天开始，用 Alg/HA/Gel 打印的球体就显示出中心有一个活的绿色核心，周围环绕着死细胞，如图9所示。尽管添加了 PMA 来刺激发芽和迁移，但与其他生物墨水相比，几乎没有观察到球体的发芽或迁移。在 ADA-GEL 芽中打印的球体中，第一天就可以观察到这一点（图 10）。早在第一天就观察到零星迁移的细胞。与其他墨水相比，ADA-GEL 中形成的芽往往是最长的（图 11 a、b）。第一天，GelMA 中的球体与 ADA-GEL 中打印的菌落表现出相似的行为。发芽形成清晰可见（图10）。与 ADA-GEL 一样，第一天也可以检测到细胞的零星迁移。GelMA 中的芽的数量及其长度并不显着低于 ADA-GEL，但相反，在统计学上显着高于 Alg/HA/Gel。第一天，在基质胶中也可以检测到球体的发芽。然而，与 ADA-GEL 和 GelMA 水凝胶一样，第一天仍无法观察到迁移的细胞。
图 10. ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel 中可见发芽的示例图像。上图：活的（绿色）和死的（红色），下图与相差融合。比例尺 = 100 μm。
图 11. ( a ) 第 1 天在水凝胶中形成的芽的数量，( b ) 在凝胶中形成的芽的长度，( c ) 第 2 和第 3 天迁移最远的三个细胞的迁移距离，( d ) 球体面积第 1、2、3 和 4 天。数据表示为平均值±标准差。* p < 0.05。
在第 2 天，几乎没有观察到更多的迁移细胞，并且在 Alg/HA/Gel 中，与第 1 天（图 9 ）相比，球体中心的绿色活核逐渐变小。如图11c所示，第二天，在 ADA-GEL 和 GelMA 中已经观察到较宽的细胞迁移距离。第 2 天，在 ADA-GEL 和 GelMA 中几乎检测不到芽的形成；相反，细胞迁移远离第一天形成的芽。ADA-GEL 和 GelMA 中三个迁移最远的细胞的距离在统计学上显着高于 Alg/HA/Gel（其中没有细胞迁移）。然而，第2天，在Matrigel中仍然检测到芽。然而，2天后，在Matrigel中尚未观察到细胞的迁移。
第 3 天，Alg/HA/Gel 中球体的总面积随着时间的推移仅略有下降（图 11d）。随着时间的推移，该地区变化不大。相反，集落中的细胞死亡，区域的红色部分与最初的绿色核心相比有所增加（图9）。第 3 天，在 ADA-GEL 中可以看到更多细胞的迁移。在 GelMA 中观察到相同的行为（图 9）。在 GelMA 中检测到从第 2 天到第 3 天细胞迁移距离呈增加趋势。ADA-GEL 和 GelMA 中三个最远细胞的迁移距离在统计学上显着高于 Alg/HA/Gel，因为在第 3 天没有检测到迁移（图 11）C）。第 3 天，嵌入基质胶中的球体在核心周围显示出大量迁移细胞。在球体核心上仅可见孤立的芽。ADA-GEL 和 GelMA 的球状面积逐日减少，Alg/HA/Gel 的球状面积也是如此。然而，这里也没有观察到统计上显着的变化（图 11d）。
在第4天，与第3天相比，在Alg/HA/Gel中未观察到球体的重大变化(图9 )。ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel 中单细胞的迁移随着时间的推移持续增加，并且在初始核心区域周围观察到的迁移细胞较少。就球体面积而言，任何生物墨水均未发现统计学上的显着差异（图 11d）。
第 7 天，在所有球体中检测到相似的形态。7天后，球体的死核仍然存在（图9）。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，最初的活细胞在核心中缓慢死亡，而在其他水凝胶中，大多数活细胞已经迁移走。在基质胶中，在球体核心周围可以检测到最大数量的迁移细胞。在 ADA-GEL 和 GelMA 中，细胞的迁移提前一天开始，细胞已经迁移到远离球体核心的地方。
在本研究中，详细研究了嵌入三种不同水凝胶 Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 中的内皮细胞的细胞存活、出芽、迁移和增殖。为此，将细胞打印为单细胞，并以球体的形式封装在墨水中，以阐明水凝胶对血管生成的适用性。另外，还将墨水中细胞的行为与标准材料基质胶进行比较。基质胶是一种源自小鼠肉瘤的基底膜基质，被认为是许多细胞培养应用的标准材料。然而，基质胶的应用受到限制，因为其成分复杂、定义不明确、高度可变，并且生物打印的形状保真度不足[ 7，32 ]。虽然 GelMA 中内皮细胞的行为已在文献中多次描述，但在生物打印背景下它们在其他两种水凝胶中的行为在之前的研究中尚未得到如此详细的研究 [ 33 ]。
Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 油墨具有足够好的印刷精度和形状保真度。对于 ADA-GEL，观察到最高 DCR 为 0.57 (± 0.05)。Bednarzig 等人的一项研究中。(2022) [ 30 ]，以生物活性玻璃作为填料的藻酸盐水凝胶可以确定约 0.75 的高 DCR。而在 Heid 等人的另一项研究中。(2022) [ 34 ]，ADA-GEL 与生物活性有机填料组合的 DCR 为 0.5。ADA-GEL 良好的印刷适性主要归功于预交联，它显着提高了形状保真度 [ 24]。尽管为油墨确定的 DCR 很好，但将来可以通过添加有机填料等进一步改进，从而获得更精确的结果。振荡测量证明了油墨的剪切稀化行为。剪切稀化行为降低了负载下油墨的粘度，并在卸载时恢复到更粘稠的状态，这可以支持形状保真度[ 35 , 36 ]。因此，剪切稀化行为对于基于挤出的打印尤为重要，因为挤出过程中打印针的较高剪切速率有利于水凝胶更好的沉积[ 35]。此外，基于挤出的生物打印的缺点是，当使用较高的压力或较小直径的针时，细胞存活率会降低，并且材料不存在剪切稀化行为[ 36,37,38 ]。
根据进行的频率扫描，还可以证明水凝胶在 15°C 时的凝胶状材料行为，因为在所有测量的频率下 G' 都大于 G''。由于打印是在冷却过程之后直接进行的，因此确定的 DCR 值是指第一次频率扫描。在所有水凝胶中观察到的从粘度 1 到粘度 2 发生的小幅向上移动可归因于水凝胶的逐渐凝胶化。在ADA-GEL中，由于与其他油墨相比，油墨中的聚合物含量较高，因此粘度最高。对于所有油墨，在印刷温度下 G' 远高于 G''，表明沉积后暂时具有良好的形状保真度。基于这些结果，可以假设所有墨水都最适合生物打印。
在评估 MicroTester LT 测量时，观察到 Alg/HA/Gel 的弹性模量最低。这可归因于 Alg/HA/Gel 油墨中负责交联密度的藻酸盐浓度相对较低。Schmid 等人的研究表明，增加藻酸盐含量也大大增加了刚度。（2021）[ 7 ]。这允许定制墨水。
观察到的 ADA-GEL 刚度在第 1 天为 1.72 ± 0.88 kPa，在第 14 天为 2.44 ± 0.69 kPa。明胶与 mTG 的交联导致 ADA-GEL 的弹性模量显着高于 Alg/HA/Gel，因为这增强水凝胶基质[ 26 ]。此外，ADA-GEL 中的藻酸盐浓度显着高于 Alg/HA/Gel 墨水中的藻酸盐浓度。通过使用不同浓度的mTG进行交联，可以调节刚度[ 26 ]。在 ADA-GEL 中观察到的硬度在几天内增加可能是由于非交联明胶的释放 [ 26]。由于孵育过程中温度从室温 (22 °C) 升高至 37 °C，明胶与剩余 mTG 可能会发生进一步交联。这将导致刚度增加。过去的一项研究还报道，pH 值的增加会导致 mTG 交联。所形成的构建体在 pH 值为 6 时比在更酸性的 pH 条件下稳定得多 [ 39 ]。因此，可以假设，随着时间的推移，将构建体转移到pH约7的细胞培养基中导致明胶与ADA-GEL中含有的残余量的mTG进一步交联。这可以解释 ADA-GEL 硬度的增加。
对于 GelMA，研究中测量了最高的杨氏模量。过去也曾对由 5% GelMA 制成的水凝胶测量过与本研究中测量的类似的弹性值。此外，吴等人的研究也表明了这一点。(2019) [ 40 ] 将 GelMA 浓度增加到 10% 也会导致弹性模量提高 10 倍。
对于软组织，可在文献中找到1 kPa（肝脏）[ 41 , 42 ] 至 8 kPa（心肌、肾脏）的硬度值。对于上皮层，测得杨氏模量为0.11 kPa。相比之下，网状真皮显示出更高的杨氏模量，为 160 kPa [ 43 ]。
过去已证明硬度是细胞行为和粘附的调节剂。顺应性底物已被证明可以促进内皮细胞网络形成和管状形成[ 44 ]。桑德斯等人观察到了这一点。(2010) [ 45 ] HUVEC 在不同杨氏模量的惰性聚丙烯酰胺凝胶和杨氏模量为 0.14 kPa 和 0.675 kPa 的软凝胶上形成二维网络。相反，在 1.05 至 2.5 kPa 范围内的较高杨氏模量下观察到细胞扩散而不是稳定的网络形成。这是由于较软基质上的细胞形成的细胞-基质粘附较少，因此细胞-细胞粘附占主导地位[ 45]。因此，HUVEC 定向迁移到组织中是由足够的刚度梯度支持的。相反，太大的刚度（高于 4 kPa）会充当机械屏障，对迁移产生负面影响，甚至可能完全阻止网络形成。类似地，过低的刚度可以防止管形成。因此，0.5 至 2.5 kPa 范围内的刚度会导致迁移增加，也会导致芽形成增加 [ 46 ]。因此，本研究中测得的刚度均在上述范围内（0.5-2.5 kPa且低于4 kPa），这在之前的研究中已被确定为协调迁移和粘附的刚度范围[ 46 ]。
就降解行为而言，所有凝胶在 14 天内都观察到缓慢的质量损失。这证明了水凝胶的成功交联。合适的交联策略至关重要，特别是对于水凝胶而言，因为它们的快速降解是许多应用的障碍。
对于基于藻酸盐的水凝胶，通常使用钙进行交联。然而，历史上，与钡的交联也导致了具有高强度和较慢的明胶释放的结构。没有观察到钡的细胞毒性作用[ 47 ]。此外，据报道，ADA-GEL的降解速率可以通过添加不同浓度的mTG来调节[ 26 ]。Alg/HA/Gel 与 mTG 的额外交联除了增加刚度外，还可以减缓 Alg/HA/Gel 的降解速度。这将允许调整 Alg/HA/Gel 混合物的降解行为。此外，与 mTG 交联可能会导致刚度增加。
对于 GelMA 的降解行为，Heltmann-Meyer 等人的一项研究在 14 天后观察到类似的质量损失 18.70%。（2021）[ 11 ]。可以得出结论，GelMA 的紫外线交联会产生缓慢降解的稳定结构 [ 48 ]。由于其缓慢降解，除了血管组织工程应用之外，GelMA 还可以用作长期应用的墨水，例如药物衍生组织容器或骨组织工程 [ 11,49,50 ]。长期应用可能需要缓慢降解（数月至数年）的生物材料，同时促进血管生成[ 11]。对于软骨再生来说，几周的时间足以让软骨细胞建立自己的 ECM。因此，本文研究的墨水 Alg/HA/Gel、ADA-GEL 和 GelMA 的降解行为是可以很好控制的，并且可以根据相应的应用进行定制。
比较三种印刷油墨，细胞在 ADA-GEL 和 GelMA 水凝胶中迁移和存活良好，而在 Alg/HA/Gel 中则无法检测到上述行为。这表明最初为肿瘤细胞开发的墨水并不适合内皮细胞网络形成的环境。尽管 Schmid 等人证明了高生物相容性和良好的细胞存活率。(2021) [ 7 ] 同样对于用墨水打印的永生化脂肪源性间充质干细胞 (ADSC)，这对于 Alg/HA/Gel 墨水中的 HUVEC 细胞系无法得到证实。Schmid 等人还可以在 Alg/HA/Gel 墨水中证明肿瘤细胞的存活。(2021) [ 7]。然而，与肿瘤细胞不同，HUVEC 不能从单个细胞增殖。此外，HUVEC 细胞由于其极性而无法形成多细胞结构来自我定向。此外，细胞不能通过墨水迁移。墨水中 HUVEC 细胞的死亡也可归因于海藻酸盐的量，其特点是细胞与材料相互作用不足和细胞附着效率低下。
从第 7 天开始观察单个细胞，在 Alg/HA/Gel 中观察到大量死亡细胞，并且随着时间的推移而增加。从第一天开始，球体外边缘的死细胞数量表明墨水没有为水凝胶内的细胞的生存提供合适的环境。在 ADA-GEL 中，海藻酸盐以海藻酸二醛的形式存在，已进行共价交联。之前的研究表明，预交联的海藻酸盐具有良好的粘弹性，可以促进细胞迁移[ 51 ]。因此，通过部分氧化和预交联可以克服海藻酸盐的缺点，使ADA-GEL为HUVEC提供比普通海藻酸盐、ADA-GEL或Alg/HA/Gel更好的环境[ 9]]。因此，本研究中使用的预交联 ADA-GEL 据称比以前使用的 ADA-GEL 配方具有显着的进步。
将嵌入 ADA-GEL 和 GelMA 的细胞的发育与嵌入 Matrigel 的 HUVEC 的发育进行比较，发现了类似的行为。在 ADA-GEL、GelMA 和 Matrigel 中，单细胞的细胞存活和增殖可持续 14 天。与 GelMA 不同，打印一天后在 ADA-GEL 中观察到大量死细胞，这可能是由于墨盒中充满了细胞，并且 ADA-GEL 额外以 872× g离心打印前 7 分钟。当使用 ADA-GEL 去除凝胶中的气泡进行打印时，此步骤是必要的。可以假设作用在细胞上的离心力对其生存能力产生负面影响。用于交联 ADA-GEL 的 mTG 不太可能导致细胞死亡增加。多项研究表明，即使使用较高浓度的 mTG 也不会导致细胞活力降低 [ 39 , 52 , 53 , 54 ]]。然而，在ADA-GEL和GelMA中，发现7天后内皮细胞在凝胶表面生长良好，并且在表面上可以观察到细胞与细胞的接触。对打印在支架上的细胞进行超过 14 天的代谢活性测定也证明了 ADA-GEL 和 GelMA 水凝胶的高生物相容性。
内皮细胞迁移到周围的水凝胶中，这是血管生成过程中新血管形成的重要步骤，通过对ADA-GEL和GelMA超过7天的球体观察进一步证实[ 46 ]。球体的形成使细胞能够紧密地堆积在一个小体积中，增强细胞间的相互作用，从而模仿组织结构[ 55 ]。选择悬滴法来制备球体，因为它可以用来生产少量且易于控制尺寸的球体[ 56 , 57 ]。然而，对于水凝胶中打印的球体，只能检测到细胞的强烈迁移，而尚未检测到网络的形成。
第 0 天，Matrigel 中的球体仍然特别圆且有活力。与其他水凝胶相比，没有观察到死区。这可能是因为生物打印基质胶所施加的压力最低。对于其他三种水凝胶，使用了更高的压力。由于变形和剪切力，较高的压力可能会对外膜造成轻微损坏。因此，在某种程度上可以看到球体内部的死红色中心。从第一天起在 ADA-GEL 和 GelMA 中观察到的球体周围的圆形细胞表明，随着时间的推移，尖端细胞迁移发生，但随后没有茎细胞迁移。丝状伪足覆盖的尖端细胞对于芽的形成很重要，因为它们为后续的茎细胞提供了方向。茎细胞具有长而细长的形态，58、59 ]。 从第 2 天起，在 ADA-GEL 和 GelMA 中就不再检测到茎细胞的形成。只有在 Matrigel 中，直到第 3 天才观察到茎细胞的形成。随着时间的推移，三种水凝胶中尖端细胞的迁移持续增加，因此到第 7 天，原始球体核心中的死亡细胞仍然存在。那些一开始尚未死亡的细胞迁移通过凝胶，但尚未对齐或形成网络。这可能是该时间段的基础，因为之前的研究也观察到 14 天后的球体网络形成比 7 天后更好[ 55]。此外，这种效应可能是因为支架上打印的球体明显减少，而整个支架中大量存在单细胞，这可能促进球体之间更好的细胞间相互作用。更好的细胞间相互作用可以对细胞存活和网络形成产生积极影响。在未来的研究中，在水凝胶中添加更多数量的球体可以增加细胞与细胞的接触和网络形成。
球体内内皮细胞的死亡不能追溯到打印过程，但如果没有 VEGF 和 FGF-2 等存活因子的保存，球体培养物中就会发生内皮细胞的死亡。HUVEC 球体形成两室系统。它由具有分化细胞的表面单层和具有无组织细胞的中心组成。中心的无组织细胞除非被生存因子拯救，否则就会因凋亡而死亡。通过细胞与细胞的接触，内部的细胞容易受到生存因子的影响，从而实现球状聚集[ 60、61、62 ]]。尽管培养基中含有 VEGF，但本研究中并未进一步研究或改变其浓度，以确保球体中心无组织细胞的存活。此外，添加的 VEGF 浓度也是未知的，因为制造商没有披露。由于 7 天后在 Matrigel 中打印的球体中也没有检测到管的形成，因此不能认为 ADA-GEL 和 GelMA 水凝胶在某种程度上缺乏促进血管生成的能力。更有可能的是促进血管生成的其他重要因子（例如 VEGF 或 bFGF）的含量太低 [ 33 , 61 , 63 , 64 ]]。迁移也可能受到低粘附力的影响，导致迁移过程中膜起泡[ 65 ]。细胞-基质粘附还受到内皮整合素受体的影响，内皮整合素受体与 ECM 蛋白通讯并介导粘附，调节茎细胞和尖端细胞的增殖和迁移。
克莱奇默等人。(2021) [ 46 ] 报道，例如，层粘连蛋白（一种 ECM 蛋白）的存在对于管的形成是必要的。先前的研究还表明，向嵌入纤维蛋白凝胶的 HUVEC 中添加皮肤成纤维细胞会导致具有管腔的血管网络的形成，而在没有皮肤成纤维细胞的情况下，内皮细胞会迁移，血管形成受到限制 [ 66 ]。因此，添加皮肤成纤维细胞可能对未来的研究很有趣。在布雷等人的一项研究中。(2015) [ 67]，还表明，在基质金属蛋白酶（MMP）敏感的四臂星形聚（乙二醇）（starPEG）-肝素水凝胶中培养 HUVEC 仅通过添加精氨酰甘氨酰天冬氨酸和促血管生成即可导致管形成细胞因子，支持这样的假设：通过添加血管生成信号，可以在此处描述的 ADA-GEL 和 GelMA 水凝胶中发生血管形成 [ 67 ]。同样，Ermis (2021) 的另一项研究将干细胞和 HUVEC 在球体中一起培养并将其嵌入 GelMA 中，证明了更明显的网络形成 [ 55 ]。Rana D 等人的一项研究中。(2022) [ 68]，还表明，将 VEGF 与封装在 GelMA 中的 50-丙烯酸酯修饰适体以及 HUVEC 和人间充质基质细胞 (hMSC) 结合，可导致 VEGF 的受控释放。由于受控释放，不仅可以检测到管腔状微血管网络，还可以检测到时间控制的网络组织。因此，这项研究也再次证实了添加 VEGF 及其对受控网络形成的控制的相关性 [ 22 , 68 ]。在 Ruther 等人的进一步研究中。(2019) [ 20]，使用手工双针挤出系统生产血管结构，其由外层的 ADA-GEL 和内层的牺牲明胶组成。成纤维细胞和内皮细胞的培养证实了整个时期的迁移，但尚未证实毛细血管网络[ 20 ]。因此，为了形成更大的血管，使用牺牲墨水将来可能有助于在此处研究的 GelMA 和 ADA-GEL 墨水中创建空腔 [ 1 ]。
ADA-GEL 和 GelMA 这两种有前途的预交联墨水由于其最佳的机械性能和优异的生物相容性，未来应进一步研究其血管生成潜力。为了实现网络形成，应添加足够浓度的血管生成因子。
本研究对Alg/HA/Gel、ADA-GEL和GelMA这三种水凝胶进行了多方面的研究，并将HUVECs的存活率与标准材料Matrigel进行了比较。就机械性能而言，所有油墨均具有良好的印刷适性。证明了油墨的剪切稀化行为。进一步观察到合适的弹性模量以及可定制的降解行为。因此，可以说，对于所有三种研究的水凝胶，由于其机械性能，它们最适合基于挤出的生物打印。在 GelMA 和 ADA-GEL 生物墨水中，HUVEC 单细胞的存活时间长达 14 天，球体的存活时间长达 7 天。在水凝胶中也可以观察到 HUVEC 的增殖和迁移。细胞的迁移和生长优先发生在支架表面。在基质胶中可以检测到 HUVEC 的类似行为。第 7 天，在 GelMA、ADA-GEL 和 Matrigel 表面观察到单细胞的细胞接触和排列。对于球体，在 7 天的时间内可以观察到细胞通过水凝胶向表面强烈迁移。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，内皮细胞既不能以单个细胞的形式存活，也不能以球体的形式存活。尽管所有墨水都具有良好的机械性能，但 Alg/HA/Gel 生物墨水被证明不适合细胞研究中的血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。在基质胶中可以检测到 HUVEC 的类似行为。第 7 天，在 GelMA、ADA-GEL 和 Matrigel 表面观察到单细胞的细胞接触和排列。对于球体，在 7 天的时间内可以观察到细胞通过水凝胶向表面强烈迁移。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，内皮细胞既不能以单个细胞的形式存活，也不能以球体的形式存活。尽管所有墨水都具有良好的机械性能，但 Alg/HA/Gel 生物墨水被证明不适合细胞研究中的血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。在基质胶中可以检测到 HUVEC 的类似行为。第 7 天，在 GelMA、ADA-GEL 和 Matrigel 表面观察到单细胞的细胞接触和排列。对于球体，在 7 天的时间内可以观察到细胞通过水凝胶向表面强烈迁移。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，内皮细胞既不能以单个细胞的形式存活，也不能以球体的形式存活。尽管所有墨水都具有良好的机械性能，但 Alg/HA/Gel 生物墨水被证明不适合细胞研究中的血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。对于球体，在 7 天的时间内可以观察到细胞通过水凝胶向表面强烈迁移。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，内皮细胞既不能以单个细胞的形式存活，也不能以球体的形式存活。尽管所有墨水都具有良好的机械性能，但 Alg/HA/Gel 生物墨水被证明不适合细胞研究中的血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。对于球体，在 7 天的时间内可以观察到细胞通过水凝胶向表面强烈迁移。在 Alg/HA/Gel 生物墨水中，内皮细胞既不能以单个细胞的形式存活，也不能以球体的形式存活。尽管所有墨水都具有良好的机械性能，但 Alg/HA/Gel 生物墨水被证明不适合细胞研究中的血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。Alg/HA/Gel 生物墨水在细胞研究中被证明不适合血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。Alg/HA/Gel 生物墨水在细胞研究中被证明不适合血管组织工程。可以得出结论，ADA-GEL 和 GelMA 生物墨水为血管组织工程提供了有前景的基质。
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